1. fastq數(shù)據(jù)不可直接合并，墨卓數(shù)據(jù)與10x數(shù)據(jù)的reads結(jié)構(gòu)并不一致，barcode白名單也不相同；

可以被分為兩種情況：

1. 使用--intron excluede參數(shù)時(shí)，一條read只有比對(duì)到一個(gè)基因的外顯子區(qū)域（read有超過(guò)50%的長(zhǎng)度比對(duì)到了外顯子區(qū)域），才會(huì)進(jìn)入計(jì)數(shù)，如果比對(duì)到內(nèi)含子區(qū)域或基因間區(qū)，則不進(jìn)入計(jì)數(shù)；

針對(duì)不同的服務(wù)器配置及參數(shù)設(shè)置，100G數(shù)據(jù)運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)并不完全相同。以Hygon C86 7285H 32-core Processor (2.5GHz)處理器為例:

1. 針對(duì)10G測(cè)序量的樣本，增加線程數(shù)并不能顯著降低分析時(shí)間，但會(huì)大大增加內(nèi)存的使用量，因此10GB左右的文庫(kù)推薦2-8線程；

2. 針對(duì)100G測(cè)序量的樣本，當(dāng)線程在24以下時(shí)，并不會(huì)顯著增加內(nèi)存的使用量，但可以顯著減少分析時(shí)間；當(dāng)線程設(shè)置在24以上時(shí)，內(nèi)存使用量開始明顯增加，因此100GB左右的文庫(kù)推薦16-24線程；

3. 運(yùn)行的時(shí)間和內(nèi)存消耗與文庫(kù)本身大小及設(shè)置的線程數(shù)有關(guān)，當(dāng)文庫(kù)大小達(dá)300GB時(shí)，我們建議分析時(shí)的內(nèi)存不少于64GB。

1. 過(guò)去試劑版本的墨卓單細(xì)胞3'轉(zhuǎn)錄組試劑盒制備的文庫(kù)，都可以使用MobiVision-v3.2進(jìn)行分析。

1. 新增命令integrate，擴(kuò)展了命令集。

2. 加入了新的cutadapt序列剪切步驟，并改進(jìn)了過(guò)濾方法以確保更干凈的polyA切除。

3. 結(jié)果文件中的bam文件內(nèi)容調(diào)整，增加unmapped reads信息和新的tag，改進(jìn)了mapping info及seq saturation計(jì)算。

4. 更新了h5ad文件，改為包含完整矩陣信息。

5. 增加了cell_metrics文件及total genes detected信息，并寫出于summary.csv文件中。

6. 改進(jìn)了HTML報(bào)告的物種信息讀取及mapping information參數(shù)調(diào)整，使其更接近c(diǎn)ellranger的設(shè)置。

測(cè)序飽和度反映了全部測(cè)序片段整體的復(fù)雜性和測(cè)序深度，可通過(guò)計(jì)算含有有效條形碼和UMI、且能對(duì)比至基因組唯一區(qū)域的測(cè)序片段的冗余度來(lái)獲得。Sequencing Saturation = 1 - non-duplicated_unique_mapped_reads / total_unique_mapped_reads。對(duì)于通過(guò)mobivision quantify獲得的bam文件而言, MAPQ=255代表能比對(duì)至基因組唯一比區(qū)域的測(cè)序片段。所以，total_unique_mapped_reads可通過(guò)計(jì)算MAPQ=255的測(cè)序片段中，UMI和Barcode通過(guò)糾正的測(cè)序片段數(shù)獲得; non-duplicated_unique_mapped_reads可通過(guò)計(jì)算MAPQ=255的測(cè)序片段中，UMI和Barcode不重復(fù)的測(cè)序片段數(shù)獲得; 代碼如下：

mobivision mkindex命令可用于構(gòu)建reference參考基因組，且指定不同的-m參數(shù)，使用不同來(lái)源的參考基因組，均會(huì)導(dǎo)致構(gòu)建的reference參考基因組大小并不一致，-m指定值越大，構(gòu)建的參考基因組也越大，且分析速度也會(huì)更快。-m默認(rèn)值為16，若使用默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建人的reference，其參考基因組文件夾大小約為19G，構(gòu)建reference代碼如下：

mobivision quantify目前提供兩種細(xì)胞過(guò)濾的算法，分別是CR2.2和EmptyDrops （Lun等人于2019年發(fā)表在Genome biology中的算法）。如果用戶需要指定細(xì)胞數(shù)目，也可通過(guò)--cellnumber INT 來(lái)選擇含有UMI數(shù)目排列前INT個(gè)的細(xì)胞標(biāo)簽作為有效細(xì)胞。

CR2.2算法（見上圖左Panel）：首先將barcode按UMI數(shù)從大到小排序，設(shè)N為期望細(xì)胞數(shù)，該值默認(rèn)為3000， m 為期望細(xì)胞數(shù)的99分位barcode所對(duì)應(yīng)的 UMI 數(shù)。所有 UMI 值超過(guò) m/10 的barcode都被稱識(shí)別為細(xì)胞。（例如，當(dāng)N=3000時(shí)，99分位的barcode為第30個(gè)barcode，其UMI值記為m，當(dāng)m=20000時(shí)，m/10=2000，那么所有UMI值超過(guò)2000的barcode會(huì)被識(shí)別為細(xì)胞，圖示細(xì)胞數(shù)為9000）。

EmptyDrops算法（見上圖右Panel）： 參考Lun等人于2019年發(fā)表在Genome biology中的算法(EmptyDrops: distinguishing cells from empty droplets in droplet-based single-cell RNA sequencing data)。該算法是在 CR 2.2 的基礎(chǔ)上進(jìn)一步識(shí)別低RNA含量的細(xì)胞，步驟如下：
1. 初步細(xì)胞鑒定：與 CR 2.2 一致，使用基于每個(gè)barcode的總UMI數(shù)量的閾值來(lái)確定高RNA含量的細(xì)胞。
- 根據(jù)墨卓單細(xì)胞3'/5RNA的細(xì)胞捕獲率，預(yù)估細(xì)胞數(shù)量N
- 根據(jù)每個(gè)barcode的UMI數(shù)量降序排列，計(jì)算前N個(gè)barcode的UI數(shù)量的99分位數(shù)，記為m。
- 如果barcode的UMI總數(shù)超過(guò)m的10%，則該barcode被視為含有細(xì)胞。

2. 細(xì)胞鑒定的細(xì)化：
- 選擇具有低UMI計(jì)數(shù)的barcode，即第一步未被鑒定為細(xì)胞的barcodes。
- 針對(duì)這些barcodes的RNA圖譜，基于采用基于基因的多項(xiàng)式分布，創(chuàng)建背景模型，并通過(guò)Simple Good-Turing平滑技術(shù)為未觀察到的基因提供非零的模型估計(jì)。
- 將每個(gè)未在第一步鑒定中被識(shí)別為細(xì)胞的barcode的RNA圖譜與背景模型進(jìn)行比較，那些與背景模型明顯不符的barcode被識(shí)別為細(xì)胞。

V(D)J分析的主要目的是從原始測(cè)序數(shù)據(jù)中提取B細(xì)胞或T細(xì)胞的V(D)J基因序列與克隆型。這個(gè)過(guò)程通?？梢赃m應(yīng)不同的測(cè)序平臺(tái)和數(shù)據(jù)格式。因此，V(D)J分析流程支持多個(gè)測(cè)序平臺(tái)的FASTQ文件。

V(D)J分析流程通?？梢灾С謫味说膔eads，包括只有一端reads包含有V(D)J基因信息的情況。不過(guò)，這取決于所使用的V(D)J分析軟件和具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

對(duì)于單端的reads，V(D)J分析軟件通常會(huì)對(duì)reads進(jìn)行一些額外的預(yù)處理和過(guò)濾，以提高V(D)J重排和克隆型識(shí)別的準(zhǔn)確性。MobiVision可以處理單端或雙端的FASTQ文件，指定V(D)J基因在reads的哪個(gè)位置上，并且可以識(shí)別測(cè)序的reads來(lái)自哪些Barcodes，并確定V(D)J基因的重鏈與輕鏈，從而進(jìn)行有效的V(D)J分析。

對(duì)于特別不常見的物種，構(gòu)建一個(gè)參考基因組序列文件可能是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，因?yàn)槿狈捎玫膮⒖蓟蚪M或基因組注釋數(shù)據(jù)。以下是一些可能有用的方法：

1. 基于已知的近緣物種: 可以基于已知的近緣物種的基因組序列，利用基因組序列比對(duì)和組裝技術(shù)來(lái)構(gòu)建目標(biāo)物種的參考基因組序列。這種方法需要有足夠相似的基因組序列和足夠的比對(duì)深度。
2. RNA-Seq數(shù)據(jù)拼接: 如果目標(biāo)物種的RNA-Seq數(shù)據(jù)可用，可以利用RNA-Seq reads拼接出轉(zhuǎn)錄組序列，再利用轉(zhuǎn)錄組序列和相關(guān)的比對(duì)工具如BLAST和STAR等進(jìn)行基因組組裝和注釋。這種方法適用于不需要完整的基因組序列的情況下。
3. 亞基因組注釋: 如果沒(méi)有可用的基因組數(shù)據(jù)，可以考慮使用亞基因組注釋的方法。即先利用相關(guān)的比對(duì)工具如BLAST和HMMER等將已知物種的基因組注釋信息映射到目標(biāo)物種的基因組上，并據(jù)此推斷目標(biāo)物種的基因組組成和結(jié)構(gòu)。
4. 三代測(cè)序輔助裝配: 可以考慮使用更快速和更精確的三代測(cè)序輔助裝配技術(shù)，如Oxford Nanopore和PacBio SMRT等單分子測(cè)序技術(shù)。這些技術(shù)可以產(chǎn)生長(zhǎng)讀長(zhǎng)的測(cè)序數(shù)據(jù)，有助于更好的基因組組裝和注釋。

在進(jìn)行原始FASTQ文件的分析之前，通常需要對(duì)文件進(jìn)行命名。雖然不同的實(shí)驗(yàn)室和分析流程可能有不同的命名規(guī)則，但通常應(yīng)該滿足以下一些基本要求：

1. 文件名應(yīng)該能夠清晰地反映樣本來(lái)源，包括樣本編號(hào)、組織來(lái)源、處理方式等信息。這些信息可以用下劃線或短橫線等字符分隔，例如:
   Sample1_Blood_RNAseq_R1.fastq(.gz)與Sample1_Blood_RNAseq_R2.fastq(.gz)。
2. 文件名應(yīng)該包含一些關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)信息，例如測(cè)序類型與測(cè)序平臺(tái)等信息。這些信息可以用下劃線或短橫線等字符分隔，例如：Sample1_Blood_RNAseq_Illumina_PE.fastq(.gz)。
3. 文件名應(yīng)該能夠唯一標(biāo)識(shí)每個(gè)FASTQ文件，避免重復(fù)命名或覆蓋已有數(shù)據(jù)。可以使用獨(dú)特的文件名或帶有時(shí)間戳的命名方式，例如：Sample1_Blood_RNAseq_Illumina_PE_20220331.fastq(.gz)。

單細(xì)胞VDJ測(cè)序數(shù)據(jù)量的合適大小取決于多種因素，包括樣本復(fù)雜度、測(cè)序深度、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等。

一般來(lái)說(shuō)，單細(xì)胞V(D)J測(cè)序的目的是獲得盡可能完整的克隆型信息，因此需要足夠的測(cè)序深度來(lái)支持高質(zhì)量的重排和克隆型識(shí)別。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，每個(gè)單細(xì)胞至少需要測(cè)序到4000條reads，以保證高質(zhì)量的VDJ分析結(jié)果。

Fraction Reads in Cells是單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析中的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，用于評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和單細(xì)胞捕獲的效率。它表示在所有測(cè)序數(shù)據(jù)中，能夠被分配到單個(gè)細(xì)胞的reads所占的比例。通常來(lái)說(shuō)，F(xiàn)raction Reads in Cells越高，代表單細(xì)胞測(cè)序的效果越好，樣本中的單個(gè)細(xì)胞被捕獲的概率越高。

當(dāng)Fraction Reads in Cells比例比較低時(shí)，可能意味著以下一些情況：

1. 單細(xì)胞捕獲效率較低：可能是由于實(shí)驗(yàn)操作或測(cè)序技術(shù)等因素導(dǎo)致單細(xì)胞捕獲效率較低，需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和測(cè)序參數(shù)。
2. 樣本質(zhì)量不佳：可能是由于樣本的RNA降解與細(xì)胞質(zhì)破裂等因素導(dǎo)致的單細(xì)胞的RNA質(zhì)量不佳，進(jìn)而影響單細(xì)胞測(cè)序的效果。
3. 數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳：可能是由于低質(zhì)量的reads、低覆蓋度等因素導(dǎo)致無(wú)法將reads分配到單個(gè)細(xì)胞中，這需要進(jìn)行更嚴(yán)格的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和過(guò)濾。

值得注意的是，F(xiàn)raction Reads in Cells的理想值是依賴于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和測(cè)序技術(shù)等因素，并不存在一個(gè)固定的閾值。在進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析時(shí)，需要結(jié)合其他指標(biāo)和分析結(jié)果來(lái)綜合評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量和單細(xì)胞捕獲效率。

Paired Clonotype Diversity是單細(xì)胞VDJ測(cè)序數(shù)據(jù)中用來(lái)評(píng)估克隆型多樣性的一個(gè)指標(biāo)。它基于同一細(xì)胞中的配對(duì)的重鏈和輕鏈VDJ重排信息，計(jì)算出同一細(xì)胞中的克隆型數(shù)量，并對(duì)不同細(xì)胞的克隆型進(jìn)行聚類，得到每個(gè)聚類中包含的不同克隆型數(shù)量。Paired Clonotype Diversity指標(biāo)即為不同聚類中克隆型數(shù)量的平均值，通常用來(lái)描述單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的克隆型多樣性。

Paired Clonotype Diversity計(jì)算的具體過(guò)程如下：

1. 對(duì)每個(gè)細(xì)胞中的重鏈和輕鏈VDJ序列進(jìn)行拼接，得到一個(gè)全長(zhǎng)的VDJ序列。。
2. 利用VDJ分析軟件對(duì)全長(zhǎng)VDJ序列進(jìn)行克隆型分析，得到同一細(xì)胞中的克隆型信息。
3. 對(duì)同一細(xì)胞中的克隆型進(jìn)行聚類分析，得到不同聚類中包含的克隆型數(shù)量。。
4. 計(jì)算所有克隆型的細(xì)胞數(shù)的逆辛普森指數(shù)，得到PairedClonotype Diversity指標(biāo)。

MobiVisoion vdj的命名無(wú)需固定一種方式命名。從上述的命名規(guī)則中，我們可以看到其ReadType有四種命名形式，Suffix也有4種命名形式，目前MobiVision可以支持16種命名形式。用戶在二代測(cè)序結(jié)束下機(jī)后獲取的的fastq文件，只要命名合理，一定程度可以直接進(jìn)行MobiVision vdj分析，無(wú)需對(duì)樣本名改名。