MobiVision表觀組算法介紹-ATAC

算法概覽

mobivision atac可以用于分析MobiNova平臺下機的單細胞表觀組ATAC數(shù)據(jù)，關鍵分析步驟如下圖所示:

Barcode矯正

MobiNova平臺產(chǎn)生的ATAC文庫示意圖如下：

墨卓scATAC fastq數(shù)據(jù)為雙端測序，Read 1從5‘端到3’端分別為cell barcode，umi，MEC固定序列，insertDNA。mobivision atac在處理輸入的fastq數(shù)據(jù)時，首先會對Read1中的cell barcode進行矯正。若cell barcode存在于mobivision 內(nèi)置的whitelist中，則該read 含有有效的cell barcode，可進行下一步分析。若cell barcode不存在于whitelist中，則該read無效，丟棄。cell barcode在與whitelist中的barcode序列進行比對時，每個10個堿基，hamming距離<=1即可通過。在輸出的valid reads中，read 1序列對應的cell barcode為矯正后的cell barcode。cell barcode及UMI序列，存于read id，而非read sequence。

對于cell barcode通過糾正的reads，還需進一步去除adaptor。Read 1需要去除其3'端的MEB序列及其5‘端的MEC序列的反向互補序列，Read 2 需要去除其3’端的MEC序列，adaptor trimming允許的錯配率為0.1。經(jīng)過trimming處理后，得到valid and clean fastq，可用于后續(xù)比對。

Alignment

mobivision atac比對使用了內(nèi)置的bowtie2軟件，為雙端比對，輸出.bam結果比對文件，即包含mapped reads，也包含unmapped reads。

對于比對得到的bam文件，作進一步過濾去重處理，僅保留雙端比對，且MapQ >= 30的

alignments，僅保留長度 <= 2000bp的alignments，根據(jù)比對信息中的cell barcode、染色體名、比對起點和比對終點，去除重復的片段，得到過濾去重后的filtered.bed文件，并利用該文件生成可視化的bw文件。若該樣本為雙物種樣本，則每個物種各生成一個對應的bw文件。

Peaks Calling and Annotation

使用mobivision atac內(nèi)置的macs2軟件，以去重過濾處理后的filtered.bed進行peak calling。若不指定peaks類型，則默認使用narrow peak type，若需call broad peak，則需指定--peaktypebroad。若指定了--control，則call peak時，以IgG數(shù)據(jù)作為control，矯正背景噪音。最終輸出以.narrowPeak或.broadPeak為后綴的peaks文件。對于得到的peaks文件，進行注釋，注釋原則如下：

啟動子區(qū)（promoter region）是指轉錄起始位點（transcript start site）上游1000bp，到下游100bp的區(qū)間（-1kb,+100）;

distal peak是指該peak距離離它最近的TSS不超過200kb，且其不位于啟動子區(qū)域；

distal peak又指peak與某一轉錄本有重合，但是，其既不屬于上述情況的promoter region，也不屬于上述情況的distal peak，這種peak也稱為distal peak；

除以上三種情況，其他peak均稱為intergenic peak。

Valid Fragments

Valid Fragments即fragments in peaks，定義為fragment有1個堿基落于peak內(nèi)，即判定為fragmentsInPeaks。用該數(shù)據(jù)作為輸入，進行cell calling。

Cell Calling

mobivision atac目前過濾細胞采用動態(tài)閾值策略進行細胞barcode篩選：首先將所有barcode按其落入peak區(qū)域的片段數(shù)降序排列，取期望細胞數(shù)N（默認3000）的95分位數(shù)位置（即第2850位當N=3000時）對應的片段數(shù)作為m值；然后將m/10設為判定閾值，所有片段數(shù)超過該閾值的barcode均被識別為有效細胞。例如當N=3000且m=20000時，閾值設為2000，此時所有片段數(shù)超過2000的barcode將被保留（圖示案例篩選得到9000個細胞）。該方法的優(yōu)勢在于能根據(jù)數(shù)據(jù)特征自動調(diào)整篩選標準，確保不同規(guī)模數(shù)據(jù)集都能獲得可靠的細胞識別結果。