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轉(zhuǎn)錄組2＋3！墨卓平臺推出單細胞全長轉(zhuǎn)錄組解決方案
網(wǎng)站編輯：墨卓生物 │ 發(fā)布時間：2023-08-15
近日，墨卓生物聯(lián)合及智醫(yī)學，基于Nanopore平臺，推出單細胞全長轉(zhuǎn)錄組解決方案，實現(xiàn)高通量、低成本的單細胞全長序列分析。該方案為科研人員發(fā)現(xiàn)新的細胞類型、研究細胞發(fā)育和分化的過程，以及探索各種疾病的發(fā)生機制提供新的研究利器。
單細胞轉(zhuǎn)錄組作為“入門級”單細胞技術(shù)，可以幫助我們了解到細胞間異質(zhì)性、識別細胞類型特異性基因等信息，通常是基于二代測序平臺，采用短讀長的RNA測序方法。雖然該方法可以定量描述基因表達水平，但無法精細區(qū)分基因不同異構(gòu)體。
三代測序可以解決讀長較短和無法獲取全長轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)的局限性，通過二代測序＋三代測序聯(lián)用的方法，可以獲得單細胞轉(zhuǎn)錄本的全長序列并定位細胞亞群，實現(xiàn)基因突變、融合基因、拷貝數(shù)變異、非編碼RNA和可變剪切等研究。單細胞水平全長轉(zhuǎn)錄本的定量和定性分析，能夠為各類疾病發(fā)病原因及精準治療提供更全面的信息。
在制備單細胞懸液過后，通過MobiNova?-100平臺對單細胞mRNA進行捕獲，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用同一份cDNA分成兩部分，分別構(gòu)建二代測序文庫和三代測序文庫。其中，墨卓優(yōu)化了整體的實驗流程，通過二、三代測序優(yōu)勢互補，可以獲得更加精細的細胞聚類、細胞注釋、mRNA全長序列及結(jié)構(gòu)信息。
1. 細胞懸液制備
根據(jù)不同組織類型，選擇合適的細胞懸液制備方案。
所制備的細胞懸液，需要符合以下條件：
l 細胞數(shù)目：大于1×105個
l 細胞活性：大于80%
l 細胞大?。盒∮?0μm
l 無明顯結(jié)團和碎片
2. 獲得全長cDNA
在MobiNova?-100高通量單細胞建庫系統(tǒng)上結(jié)合MobiCube?高通量單細胞3’轉(zhuǎn)錄組試劑完成單細胞捕獲，并獲得單細胞全長cDNA。
詳細操作見《MobiCube?高通量單細胞 3' 轉(zhuǎn)錄組試劑用戶手冊》。
3. 二代建庫測序及分析
a. 吸取一定量的cDNA，參考《MobiCube? 高通量單細胞 3' 轉(zhuǎn)錄組試劑用戶手冊》構(gòu)建測序文庫并測序；
b. 使用MobiVision?生信軟件進行數(shù)據(jù)分析，軟件使用方法見《MobiVision?高通量單細胞多組學生信分析軟件使用教程》。
4. Nanopore建庫測序及分析
a. 完成步驟3.a之后，保留100-200ng cDNA作為備份，吸取全部剩余cDNA（N ng），使用MobiCube 3’ 轉(zhuǎn)錄組建庫試劑盒繼續(xù)擴增M循環(huán)（循環(huán)數(shù)計算方式參考公式：N×2(M-2)=1500）；
b. 純化后獲得1.5-2μg cDNA（若cDNA總量不足1.5 μg，可繼續(xù)補擴增），并進行Nanopore測序，建議測序量為100G/萬細胞 ；
c. 使用MobibarCheck軟件對Nanopore測序原始數(shù)據(jù)進行校正，軟件下載鏈接和使用說明可點擊文末閱讀原文鏈接獲取。
三代全長轉(zhuǎn)錄測序獲得1.5-2萬個基因的同時，轉(zhuǎn)錄本的種類可以達到5-8萬種，平均每個基因有3-5條轉(zhuǎn)錄本
左圖為轉(zhuǎn)錄本長度分布，右圖為基因轉(zhuǎn)錄本條數(shù)
PSCA（前列腺干細胞抗原基因）在單細胞二代測序的上皮細胞亞群中是泛表達，并未在左側(cè)的惡性上皮中特異性表達，但是，PSCA的一條轉(zhuǎn)錄本，卻是在左側(cè)的惡性上皮細胞亞群中特異性表達。
左圖為二代測序PSCA基因表達，右圖為該基因的轉(zhuǎn)錄本表達
在本次測試中，部分樣品可以檢測出約1萬條融合序列，并均可以歸類到具體亞群中，非常方便查看哪個亞群更容易發(fā)生融合基因事件。
融合基因在亞群分布比例統(tǒng)計和亞群映射
以上就是MobiCube? 3’ 單細胞全長轉(zhuǎn)錄組解決方案的實驗流程介紹和部分實測數(shù)據(jù)展示。
單細胞全長轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用范圍廣泛，在識別細胞周期、腫瘤細胞異質(zhì)性研究、鑒定罕見細胞類型、免疫細胞分型、干細胞分型、疾病分型等領(lǐng)域擁有極大的潛力，墨卓生物聯(lián)合及智醫(yī)學，在整個實驗流程及數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點進行了全面系統(tǒng)地優(yōu)化，最大程度保證實驗穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)的高效利用，可以幫您從容應(yīng)對日益深入的科研需求，緊跟科研熱點，從多個維度解析潛在的生物學信息。
閱讀原文：http://m.luckyyj.com/bioinformatics-analysis-software/mobi-bioinfo-toolkit
創(chuàng)新驅(qū)動、卓鑒未來，墨卓生物創(chuàng)立于美國波士頓，落地中國浙江，匯集了由國際一流科學家和跨國醫(yī)療器械公司高管等組成的一批優(yōu)秀人才。墨卓致力于用創(chuàng)新微流控和單細胞測序技術(shù)賦能科學研究與精準醫(yī)療。目前已經(jīng)成為擁有微流控、測序、生化、硬件開發(fā)、生信等關(guān)鍵技術(shù)，推出單細胞測序與數(shù)字PCR雙技術(shù)平臺，在液體活檢、伴隨診斷、生命科學研究等多領(lǐng)域并行發(fā)展的科研+IVD解決方案領(lǐng)跑者